成功培養(yǎng)原代嚙齒動物神經(jīng)元的7個技巧

原代神經(jīng)元培養(yǎng)物是研究細胞功能、蛋白質(zhì)相互作用和神經(jīng)毒性的有力工具，并有助于許多其他體外應(yīng)用。培養(yǎng)神經(jīng)元的一些最大挫折可能是獲得低細胞產(chǎn)量和管理細胞死亡。優(yōu)化你的神經(jīng)元準備工作流程也可能既費時又費錢。輝駿生物的蛋白質(zhì)技術(shù)人員在下文提供七個技巧，或許能幫助提高你的初級神經(jīng)元培養(yǎng)物的完整性。

1. 創(chuàng)建具有理想基材的矩陣

2. 使用胚胎組織

3. 充分分離你的組織

4. 確保使用含有正確補充劑的無血清培養(yǎng)基

5. 了解適合你實驗的密度

6. 快速工作

7. 讓你的文化適應(yīng)新環(huán)境

圖：神經(jīng)元準備的一般工作流程

1. 創(chuàng)建具有理想基材的矩陣

神經(jīng)元與塑料或玻璃的單層附著需要細胞外基質(zhì)成分和其他粘附因子，尤其是由于它們的無血清環(huán)境。為了確保你的神經(jīng)元在培養(yǎng)物中正確粘附、分化和生長，請務(wù)必在電鍍細胞之前用一種或多種底物覆蓋你的平板。神經(jīng)元培養(yǎng)最常用的底物是多聚-D-賴氨酸、多聚-L-賴氨酸、多聚-L-鳥氨酸、纖連蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白。通常，最常使用多聚-D-賴氨酸和多聚-L-賴氨酸。重要的是要注意，當使用聚 L-賴氨酸時，選擇更高的分子量 (>MW 30,000–70,000)，因為較短的聚合物可能對你的細胞有毒。此外，確?？椎恼麄€底部都被底物覆蓋，以避免細胞生長不均勻和結(jié)塊。在電鍍神經(jīng)元之前，徹底清洗所有多余的底物，因為殘留的底物可能對神經(jīng)元有毒。

2. 使用胚胎組織

最好使用胚胎動物來培養(yǎng)神經(jīng)元。產(chǎn)前動物的大腦 (E16-E18) 的神經(jīng)元具有較少廣泛的過程和連接，使細胞在解離過程中不易受到損傷。此外，產(chǎn)前大腦擁有許多未分化的細胞。當在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)時，這些細胞比已經(jīng)分化的細胞更容易分化成神經(jīng)元。相比之下，較老的腦組織的異質(zhì)性可能會用其他細胞類型（如星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞）污染培養(yǎng)物。

3. 充分分離組織

使用酶解、化學(xué)解離和機械解離的組合正確解離神經(jīng)組織非常重要。如果組織沒有正確解離，可能會發(fā)生細胞聚集，使神經(jīng)元難以在培養(yǎng)中形成正確的連接。我們建議在解剖后將神經(jīng)組織進一步切成小塊，以幫助分離。此外，請考慮你用于解離的酶。例如，膠原酶比胰蛋白酶更溫和，在解離步驟中可能需要更多時間。

4. 確保使用含有正確補充劑的無血清培養(yǎng)基

在你的培養(yǎng)基中添加血清會導(dǎo)致你的細胞不正常分化，主要是星形膠質(zhì)細胞。用于培養(yǎng)神經(jīng)元的適當培養(yǎng)基和補充劑是市售的。為了避免細菌污染的風險，請務(wù)必在培養(yǎng)基中加入適當?shù)目股?，例如青霉?鏈霉素-谷氨酰胺混合物。此外，當最初對神經(jīng)元進行電鍍時，培養(yǎng)基中的少量 L-谷氨酸 (~0.025mM) 可以幫助神經(jīng)元生長和連接。然而，為了避免細胞毒性，重要的是要了解培養(yǎng)基中的 L-谷氨酸濃度和培養(yǎng)暴露的持續(xù)時間。最后，為了長時間保持健康的培養(yǎng)，我們建議每三天用新培養(yǎng)基更換一半的培養(yǎng)基。

5. 了解適合你實驗的密度

以理想的密度電鍍神經(jīng)元細胞對于培養(yǎng)的整體健康很重要。電鍍細胞過于密集或過于稀疏都會導(dǎo)致細胞聚集，僅在電鍍幾天后就會在培養(yǎng)物中產(chǎn)生球狀體。約 1,000–5,000 個細胞的密度鋪板 2 。你的文化的理想密度取決于你的實驗問題。例如，在嘗試對單個細胞進行成像時，較低的密度是理想的，但在嘗試對低表達蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)印跡時，可能需要較高的密度。