在細胞培養(yǎng)中使用氨基酸進行穩(wěn)定同位素標記 (SILAC) 是一種基于質(zhì)譜的強大方法，可識別和量化蛋白質(zhì)豐度的相對差異變化。  2002 年首次用于定量蛋白質(zhì)組學，它提供準確的相對定量，無需任何化學衍生或操作。

SILAC實驗原理

圖 1. SILAC 的實驗原理

SILAC原理是基于代謝將穩(wěn)定同位素標記的氨基酸整合到整個蛋白質(zhì)組中。  在 SILAC 中，兩個細胞群在兩種不同的培養(yǎng)基中生長，一種是含有天然同位素氨基酸的“輕”培養(yǎng)基，另一種是含有穩(wěn)定同位素標記的氨基酸的“重”培養(yǎng)基。   在足夠數(shù)量的細胞分裂后，在“重”培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中的所有蛋白質(zhì)都含有處于重狀態(tài)的氨基酸。  使用 LC-MS/MS 分析，SILAC 的定量基于測試引入的同位素標記肽與未標記肽的比率。  來自輕質(zhì)和重質(zhì)樣品的信號強度可以定量比較它們在混合物中的相對豐度。

穩(wěn)定同位素標記SILAC實驗流程

圖2. 穩(wěn)定同位素標記SILAC實驗流程

SILAC實驗可以分為兩個階段：適應階段和實驗階段。   在適應階段，細胞在輕質(zhì)和重質(zhì) SILAC 培養(yǎng)基中生長，直到重質(zhì)氨基酸完全摻入生長的細胞中，這可以通過 MS 進行評估。   在實驗階段，根據(jù)研究目的對兩個細胞群進行不同的處理。  隨后，研究混合細胞群或蛋白質(zhì)裂解物。  然后用 LC-MS/MS 分析樣品以識別和量化重肽與輕肽的比率。

SILAC的應用

SILAC 與 LC-MS/MS 聯(lián)用已廣泛用于表征不同樣品之間的蛋白質(zhì)定量差異，研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾 (PTM) 的變化，以及區(qū)分蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (PPI) 網(wǎng)絡(luò)中的特定相互作用蛋白質(zhì)。  SILAC 有多種應用。

1. 表達蛋白質(zhì)組學： SILAC 提供了一種 體內(nèi) 策略來標記具有不同氨基酸穩(wěn)定同位素形式的蛋白質(zhì)，這使得在不同條件下監(jiān)測蛋白質(zhì)水平的定量差異成為可能。 此外，SILAC 還用于鑒定細胞器中差異表達的蛋白質(zhì)，如細胞核、核仁或細胞胰島素分泌顆粒。

2. PTM 的動態(tài)變化： 對于 PTMomics 分析，SILAC 標記肽需要經(jīng)過分級分離和富集步驟，以改進 PTM 肽的鑒定。 結(jié)合 MS 技術(shù)，SILAC 可以對 PTM 進行全局和動態(tài)分析，包括磷酸化、乙酰化、糖基化、泛素化、甲基化。 例如，研究人員使用 SILAC 和固定化金屬親和層析 (IMAC) 進行磷酸肽富集，以量化 G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路中蛋白質(zhì)響應酵母信息素信號的磷酸化變化。

3. PPI 研究：在研究 PPI 時，蛋白質(zhì)復合物從 SILAC 標記的細胞裂解物的混合物中免疫沉淀。 結(jié)合 SILAC，可以有效地區(qū)分特異性相互作用的蛋白質(zhì)和非特異性背景蛋白質(zhì)。 從誘餌樣品中純化的特定相互作用伙伴的豐度顯著高于從對照樣品中純化的，從而導致量化比率遠高于 1。相比之下，誘餌和對照中非特異性背景蛋白的豐度應具有可比性樣本，使得它們的比率接近 1?；?SILAC 的定量蛋白質(zhì)組學可用于鑒定研究外源性 PPI、內(nèi)源性 PPI 或誘導型 PPI 中的特異性相互作用蛋白。

SILAC 是一種簡單而強大的蛋白質(zhì)定量分析方法，其特點是定量準確性和重現(xiàn)性。 差異處理的樣品可以在完整細胞或蛋白質(zhì)的水平上組合，即在實驗工作流程的第一步，并且可以一起處理以最大限度地減少實驗誤差或偏差，但它只適用于細胞樣本，細胞培養(yǎng)需要很長時間。 

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