特级毛片在线大全免费播放_久久精品www人人爽人人_亚洲欧美日韩国产综合久_国产在线精品一区二区网站免费_成人性生生活性生交

標題：Circular RNA hsa-circ-0004872 inhibits gastric cancer progression via the miR-224/Smad4/ADAR1 successive regulatory circuit.

期刊：Molecular Cancer

影響因子：10.679

關鍵詞：circRNA，miRNA，miR-224，hsa-circ-0004872，p21，Smad4，ADAR1，胃癌

主要技術方法：circRNA測序，RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR），染色免疫共沉淀（ChIP-qPCR），雙熒光素酶報告基因檢測，細胞實驗和小鼠實驗等。

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在癌癥致死率方面排名第三，由于復發(fā)率高和轉移，胃癌患者的預后很差。越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA(CircRNA)在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用，探索胃癌中circRNA的表達情況和作用機制將有助于尋找新的診斷標志物和治療靶點，對提高胃癌患者的生存率至關重要。

2020年11月，山東大學基礎醫(yī)學院的研究人員發(fā)現(xiàn)在胃癌中顯著下調(diào)的circRNA——hsa-circ-0004872，其表達水平與腫瘤大小和局部淋巴結轉移有關。hsa-circ-0004872作為miR-224 的“分子海綿”來上調(diào)miR-224靶標p21和Smad4的表達，其本身受到RNA編輯酶ADAR1的抑制，miR-224靶標Smad4又可以結合ADAR1的啟動子并抑制其表達，從而正反饋調(diào)控hsa_circ_0004872的水平。該發(fā)現(xiàn)可能為胃癌的診斷和治療提供新的思路和靶點。

1.    胃癌中低表達的hsa-circ-0004872可以抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移
研究者采用circRNA測序分析了胃癌和癌旁組織中的差異表達circRNA，并在42對臨床樣本中做了qPCR驗證，最終選擇在胃癌組織中下調(diào)最顯著的hsa-circ-0004872作為研究目標。Sanger測序、發(fā)散引物擴增實驗確認了胃癌中hsa-circ-0004872的存在，進一步的臨床樣本分析表明，hsa-circ-0004872的表達水平與胃癌進程和腫瘤大小有關。RNase R處理、Northern blot檢測和轉錄抑制劑ActD處理實驗確定了hsa_circ_0004872具有比線性RNA更好的穩(wěn)定性。EdU、CCK-8、傷口愈合和transwell等細胞實驗表明，hsa_circ_0004872可以抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移，干擾hsa_circ_0004872后即有相反的效果。

2.    hsa-circ-0004872與miR-224相互作用
由于FISH檢測發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004872定位于細胞質(zhì)中，因此推測它可能作為“miRNA海綿”發(fā)揮作用。AGO2抗體的RNA免疫共沉淀（RIP）可以富集到hsa_circ_0004872，表明其通過AGO2與miRNAs結合。接下來，數(shù)據(jù)庫預測了hsa_circ_0004872的潛在靶miRNAs，發(fā)現(xiàn)只有hsa-miR-224(miR-224)具有致癌功能。RNA pull-down和雙熒光素酶報告基因實驗均表明hsa_circ_0004872與miR-224相互作用。

3.    hsa-circ-0004872通過miR-224上調(diào)其靶標p21和Smad4的表達
過表達/干擾和細胞實驗表明miR-224促進胃癌的細胞增殖、侵襲和遷移。為了確定miR-244在胃癌細胞中的靶基因，作者查找文獻并進行了WB檢測和雙熒光素酶實驗，確定了其中2個靶基因“p21”和“Smad4”。之后檢測了hsa_circ_0004872對Smad4和p21表達的影響，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004872的水平與胃癌細胞中的Smad4和p21蛋白水平呈正相關。功能回補實驗表明，hsa_circ_0004872至少部分通過miR-224抑制GC的增殖、侵襲和遷移。

4.    hsa_circ_0004872抑制體內(nèi)腫瘤生長和轉移
hsa_circ_0004872過表達胃癌細胞和對照細胞通過皮下注射和尾靜脈注射的方式導入小鼠體內(nèi)，hsa_circ_0004872過表達組形成的腫瘤平均體積遠小于對照組，HE染色顯示所有腫瘤均為實體瘤，qRT-PCR分析表明，過表達組腫瘤中hsa_circ_0004872的水平高，而miR-224的水平低。IHC結果顯示過表達組腫瘤中p21和Smad4的表達增加；此外，過表達組小鼠肺表面的轉移結節(jié)明顯小于且少于對照組。說明hsa_circ_0004872有效地抑制了體內(nèi)腫瘤的生長和轉移。

5.    hsa_circ_0004872受RNA編輯酶ADAR1調(diào)節(jié)
circRNA的形成受到核糖核酸結合蛋白的調(diào)控，通過查找基因表達數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)只有RNA編輯酶ADAR1在胃癌組織中的表達顯著高于非腫瘤組織，qPCR實驗驗證了這一結果。數(shù)據(jù)庫分析表明，胃癌組織中ADAR1的高表達與生存期較短有關。ADAR1過表達/干擾實驗確定了ADAR1蛋白對hsa_circ_0004872有抑制作用。功能回補實驗表明，ADAR1干擾導致的miR-224下調(diào)被hsa_circ_0004872 siRNA部分逆轉，表明ADAR1通過hsa_circ_0004872調(diào)節(jié)miR-224的表達。

6.    Smad4通過ADAR1調(diào)節(jié)hsa_circ_0004872水平
由于miR-224的靶基因Smad4是一種轉錄因子，因此研究了其是否可以反饋調(diào)節(jié)ADAR1的水平。預測結果顯示，ADAR1啟動子區(qū)域存在Smad4結合位點，ChIP實驗確定了Smad4可以直接與ADAR1啟動子區(qū)域結合。進一步的實驗表明，Smad4過表達導致了ADAR1蛋白和mRNA水平顯著下調(diào)，hsa_circ_0004872水平上調(diào)。雙熒光素酶也再次證明了Smad4過表達降低了ADAR1的啟動子活性。