近日，塔夫茨大學(xué)化學(xué)與生物工程系的NikhilU. Nair教授團(tuán)隊(duì)在ACS Catalysis上發(fā)表了題為“In-Depth Sequence?Function Characterization Reveals Multiple Pathways to Enhance Enzymatic Activity”的文章。

深度突變掃描 (Deep mutational scanning, DMS)已成為評(píng)估序列-功能關(guān)系、識(shí)別功能熱點(diǎn)、并加速和/或擴(kuò)大工程活動(dòng)的強(qiáng)大方法。它可以提供全面的序列-功能關(guān)系圖以探索蛋白質(zhì)適應(yīng)度景觀、發(fā)現(xiàn)新的功能相關(guān)位點(diǎn)以及確定蛋白質(zhì)工程的有益突變組合。本文作者開發(fā)了一種工作流程來設(shè)計(jì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)，并進(jìn)一步評(píng)估特定突變?nèi)绾慰朔呋^程中限制活性的不同步驟，整體流程如圖1所示。

圖1  工作流程

苯丙氨酸解氨酶(PAL)可將L-苯丙氨酸(Phe)脫氨基生成反式肉桂酸(tCA)和銨 (NH4+)，含有4-亞甲基咪唑-5-一(MIO)加合物。PAL可用于天然產(chǎn)物和精細(xì)化學(xué)品的合成以及苯丙酮尿癥的治療。雖然有大量關(guān)于PAL的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的文獻(xiàn)解釋了底物結(jié)合口袋中的殘基如何促進(jìn)底物特異性和轉(zhuǎn)換數(shù)，但是對(duì)如何通過突變不與底物直接接觸的殘基來提高酶催化性能的了解很少。

該團(tuán)隊(duì)此前開發(fā)了一種生長(zhǎng)偶聯(lián)富集技術(shù)，用于在大腸桿菌中快速篩選AvPAL的高活性變體。原理是高活性AvPAL變體可以更快地催化Phe脫氨生成NH4+，從而促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)?；诖思夹g(shù)，作者對(duì)AvPAL進(jìn)行隨機(jī)突變獲得了Naive文庫(kù)，并傳代富集了3次。然后使用高通量篩選方法對(duì)AvPAL進(jìn)行DMS，獲得其詳細(xì)序列-功能圖譜（圖2）。在第3代的突變體文庫(kù)中，218、222和453位點(diǎn)的突變高度富集（圖2a）。Naive文庫(kù)每個(gè)基因包含大約2-4個(gè)氨基酸突變，突變分布廣泛（565個(gè)殘基），每個(gè)殘基平均有5.6個(gè)替換。而第3代中只有222個(gè)位置有突變，且平均只有0.6個(gè)突變（圖2b）。負(fù)適應(yīng)度（灰色）指的是在傳代過程中出現(xiàn)頻率下降的突變，而適應(yīng)度最高的“熱點(diǎn)”T102、G218、M222L、I268、D306、G360、N453被用于后續(xù)研究（圖2c）。通過對(duì)比，作者發(fā)現(xiàn)適應(yīng)度得分與酶的催化活性具有很高的相關(guān)性。

圖2  AvPAL的DMS結(jié)果

作者計(jì)算了3個(gè)傳代突變庫(kù)相對(duì)于Naive庫(kù)的適應(yīng)度梯度，并將適應(yīng)度映射到AvPAL蛋白結(jié)構(gòu)上（圖3）。AvPAL是同源四聚體，包含四個(gè)活性位點(diǎn)，每個(gè)活性位點(diǎn)由來自三個(gè)不同單體和一個(gè)MIO基團(tuán)的殘基組成。多數(shù)有益突變距離同一鏈的活性中心較遠(yuǎn)而靠近鄰近鏈的活性中心。有趣的是，前四個(gè)突變(G218S/A、M222L和N453S)作為單位點(diǎn)突變的豐度最高，而三點(diǎn)組合突變則完全不存在，這表明有必要進(jìn)一步組合研究這些熱點(diǎn)。

圖3  識(shí)別和定位最合適的位點(diǎn)

作者利用7個(gè)熱點(diǎn)分別構(gòu)建了包含一個(gè)（7C1  7選1），三個(gè)（7C3  7選3），七個(gè)（7C7  7選7）位點(diǎn)突變的組合突變庫(kù)。7C1文庫(kù)中所有位點(diǎn)都有比野生型更適合的替換（圖 4a），而7C3和7C7文庫(kù)中較少的突變具有積極的適應(yīng)度得分（圖 4b 和 c）。這表明雖然許多突變單獨(dú)有助于提高適應(yīng)度，但大多數(shù)突變并不協(xié)同作用。對(duì)與AvPAL同源性最高的100個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行序列比較，發(fā)現(xiàn)對(duì)于218、222、306和360位點(diǎn)，天然序列中完全涵蓋了研究中發(fā)現(xiàn)的最適合的變體。而對(duì)于102、268和453位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了僅通過序列比對(duì)無法預(yù)測(cè)的新突變(圖4d)。其中，T102E-M222L和T102R-M222L-D306G的kcat分別顯示出2.4倍和2.25倍的改進(jìn)。

圖4  飽和突變庫(kù)的表征

為了揭示酶活增加的機(jī)制，作者對(duì)各突變體進(jìn)行MD模擬分析。在MD模擬期間底物和催化殘基之間的緊密接近表明穩(wěn)定的E-S復(fù)合物和近攻擊構(gòu)象的形成。通過測(cè)量變體的底物氨基氮(Phe(N))與MIO亞甲基碳(MIO(Cβ2))和相鄰鏈上314位酪氨酸羥基氧(Y314(O))之間的距離，以及對(duì)比蛋白質(zhì)主鏈原子的均方根波動(dòng)(RMSF)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于五種高活性變體中的四種（M222L、G218S、T012E-M222L和T102R-M222L-D306G），底物更容易接近催化位點(diǎn)形成穩(wěn)定的近攻擊構(gòu)象（圖5）。然而，N453S與親本相比基本沒有變化，這表明其作用方式可能不涉及直接調(diào)節(jié)底物和催化殘基之間的相互作用。

圖5  MD結(jié)果分析

由于N453S位于活性位點(diǎn)外圍，作者認(rèn)為它可能會(huì)影響底物Phe的結(jié)合過程。因此，對(duì)AvPAL和突變體進(jìn)行導(dǎo)向分子動(dòng)力學(xué)(SMD)以研究Phe從活性位點(diǎn)離開蛋白質(zhì)期間的能量變化與涉及到的相關(guān)殘基。平均力勢(shì)（PMF）圖顯示N453S有兩個(gè)最小值，而在AvPAL中沒有觀察到（圖6a）。從傘形采樣中提取Phe的構(gòu)象變化，并映射到AvPAL和N453S的結(jié)構(gòu)上（圖 6b和c）。對(duì)于AvPAL，通向活性位點(diǎn)的路徑很窄，導(dǎo)致進(jìn)入受限且在能量上不利。N453S的路徑更寬，能量更有利，底物呈現(xiàn)良好的構(gòu)象。

圖6 AvPAL、N453S的SMD和傘形采樣結(jié)果

接著作者假設(shè)N453S與其他突變體結(jié)合可能會(huì)進(jìn)一步提高酶活性，并構(gòu)建了M222L、L4P-G218S、T102E-M222L和T102R-M222L-D306G的N453S突變體。通過評(píng)估純酶的動(dòng)力學(xué)（圖7a-e）和Phe到tCA的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化（圖7f），發(fā)現(xiàn)添加N453S的變體都顯示出與親本相似的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，且vmax都有所降低，但T102E-M222L-N453S對(duì)Phe的轉(zhuǎn)化率卻提高了6倍以上。作者假設(shè)Phe可能更容易從活性位點(diǎn)取代 tCA從而減少了產(chǎn)物抑制，并隨后通過添加產(chǎn)物的方式驗(yàn)證了該假設(shè)。

圖7  N453S的動(dòng)力學(xué)表征和全細(xì)胞活性

基于此前對(duì)PAL反應(yīng)機(jī)制的研究，作者通過QM/MM模擬提出了AvPAL的反應(yīng)機(jī)理（圖8a-c），并計(jì)算出了總相對(duì)自由能圖（圖8d）。對(duì)比TS1和IS1的能量可以看出L108G < AvPAL< M222L < G218S<T102EM222L < T102R-M222L-D306G，符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖8  對(duì)AvPAL的QM/MM研究

總之，作者報(bào)告了DMS可以指導(dǎo)進(jìn)一步的蛋白質(zhì)工程，同時(shí)也為闡明催化循環(huán)局限性的基礎(chǔ)研究提供了起點(diǎn)。對(duì)含有MIO的酶AvPAL提供了最廣泛的序列功能分析，并創(chuàng)建高活性的變體。通過計(jì)算研究（QM/MM、MD 和SMD+QM/MM），揭示了突變?cè)鰪?qiáng)酶活性的機(jī)制，并獲得更優(yōu)良的突變體（T102R-M222L-N453S)。這不僅顯著推進(jìn)了PAL的酶學(xué)和工程學(xué)，而且還展示了使用DMS指導(dǎo)基礎(chǔ)和應(yīng)用酶學(xué)的能力。

蛋白組/代謝組實(shí)驗(yàn)

? iTRAQ 定量蛋白質(zhì)組學(xué)

? Label Free 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)服務(wù)

? LC-MS/MS 蛋白質(zhì)譜鑒定

? DIA 全息掃描定量蛋白質(zhì)
? 廣泛靶向代謝組學(xué)

蛋白/核酸相互作用實(shí)驗(yàn)

? GST pull down

? RNA pull down

? DNA pull down

? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯(lián)親和純化

分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

? 基因調(diào)取/合成 (cDNA克隆)

? 熒光定量PCR (qPCR)

? 載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)服務(wù)

? miRNA靶基因驗(yàn)證
? 慢病毒包裝

科研產(chǎn)品

? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體

? 人cDNA克隆庫(kù)

? 慢病毒表達(dá)載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務(wù)

? 單克隆抗體測(cè)序

? 抗體從頭測(cè)序

? 抗體表達(dá)服務(wù)

? 重組抗體表達(dá)

實(shí)驗(yàn)試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

? Flag 試劑盒

輝駿實(shí)力