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背景：
結直腸癌(CRC)是全球癌癥相關性死亡的主要原因之一，復發(fā)率和轉移率較高。闡明CRC發(fā)生和轉移的機制將有助于尋找新的診斷生物標志物和開發(fā)有效的治療干預措施。在過去的研究中已經發(fā)現(xiàn)了一些參與結直腸癌形成和發(fā)展的蛋白質編碼基因，本研究主要針對microRNA（miRNA）在CRC中的作用進行探討。

內容概述：
2019年2月，南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化內科重點實驗室在期刊Nature Communications上發(fā)表題為“The p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2 signalling axis regulates cell proliferation in human colorectal cancer”的文章，發(fā)現(xiàn)CRC組織中miR-500a-5p的低表達與CRC惡性發(fā)展相關。在CRC細胞中過表達miR-500a-5p可使其G0/G1期阻滯，抑制其生長和遷移。從機制上講，miR-500a-5p直接結合HDAC2基因并抑制其介導的裸鼠大腸癌細胞增殖。轉錄因子YY1與miR-500a-5p的啟動子結合并負調控其轉錄，且miR-500a-5p的水平還受到p300/YY1/HDAC2復合體的協(xié)同調控。小鼠模型實驗也表明miR-500a-5p表達可顯著抑制腫瘤的發(fā)展。該研究為結直腸癌治療提供了新的潛在候選基因。

主要技術：
Co-IP、ChIP、蛋白質譜檢測（LC-MS/MS）、雙熒光素酶分析等；
輝駿生物為本研究提供了蛋白質譜檢測和分析服務。

研究路線：

 
研究結果：
1. miR-500a-5p在CRC中低表達，與 CRC的惡性發(fā)展有關
研究者通過miRNA微陣列分析確定了人正常結腸上皮FHC細胞和人結腸癌細胞系SW620和LoVo中的miRNA表達譜，其中17個miRNA在2種CRC細胞中有相似的表達模式（圖1a），并從中選擇了miR-500a-5p做進一步研究。qPCR檢測確認miR-500a-5p在CRC細胞系及人類CRC組織中低表達（圖1b-d）。原位雜交（ISH）顯示miR-500a-5p定位于細胞核和細胞質中（圖1e）。此外，研究者將患者按照低表達/高表達分組，Kaplan–Meier生存曲線分析結果顯示，miR-500a-5p表達低的結腸癌患者的總體生存期較短。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR-500a5p在CRC細胞中的低表達與CRC患者的低生存率有關。

CRC的臨床病理特征分析結果表明miR-500a-5p的低表達與CRC的惡性進展有關。為探討miR-500a-5p的作用，分別在低表達miR-500a-5p的CRC細胞中轉染miR-500a-5p模擬物，在正常人結腸上皮細胞中轉染miR-500a-5p抑制劑。克隆形成實驗和EDU實驗結果表明，miR-500a-5p水平升高導致細胞增殖受到抑制，水平降低導致細胞增殖加快（圖1f-i）。FACS分析、傷口愈合、transwell遷移和侵襲實驗也進一步表明，miR-500a-5p對CRC細胞的惡性特征有抑制作用。

2. HDAC2是miR-500a-5p的靶標
采用4個公共的miRNA預測工具(miRanda, TargetScan, miRTP 和RNA22-HSA)，并結合表達譜數(shù)據(圖2a)，預測miR-500a-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)HDAC2可能是其潛在靶標 (圖2b)。首先，WB和qPCR檢測潛在靶基因HDAC2與miR-500a-5p水平是否有相關性，結果顯示10對癌組織和正常組織樣本中的HDAC2蛋白水平較高，而miR-500a-5p水平較低(圖2c，d)；81例CRC患者組織中HDAC2的mRNA水平與miR-500a-5p水平呈負相關(圖2e)。之后，采用熒光素酶報告基因實驗來確定HDAC2是否為miR-500a-5p的直接靶標，結果顯示，miR-500a-5p模擬物與HDAC2-3? UTR共轉染細胞后，熒光素酶活性降低，而當突變了3’UTR上的2個潛在結合位點中的任意一個后，miR-500a-5p都不能再抑制熒光素酶活性(圖3a，b)，進一步證實了HDAC2是miR-500a-5p的靶基因。當在CRC細胞中轉染miR-500a-5p 模擬物后，HDAC2蛋白表達下調，在正常人結腸上皮細胞中轉染miR-500a-5p抑制劑后，HDAC2蛋白表達上調(圖3c)?？寺⌒纬伞ST-1和Transwell實驗表明，HDAC2的過表達可以部分消除miR-500a-5p對細胞惡性特征的抑制作用(圖3d-f)。綜上所述，miR-500a-5p通過抑制HDAC2的表達來阻礙CRC發(fā)生和發(fā)展。
 

3. miR-500a-5p通過靶向HDAC2在體內抑制CRC細胞的生長
接下來，研究者分別將表達miR-500a-5p、m-NC、HDAC2、空載體，和同時表達miR-500a-5p/HDAC2的LoVo細胞移植到小鼠體內，建立了5種小鼠異種移植模型，評估m(xù)iR-500a-5p對體內腫瘤生長的影響 (圖4a)。結果發(fā)現(xiàn)，miR-500a-5p組的腫瘤最小，HDAC2組的腫瘤最大，miR-500a-5p/HDAC2組的腫瘤小于HDAC2組 (圖4a，b)；之后他們又檢測了五組移植瘤中細胞增殖(Ki-67)和血管生成(CD105)標志物蛋白的表達。IHC染色結果顯示，miR-500a-5p組的增殖率和腫瘤血管密度最低，HDAC2組最高， miR-500a-5p和HDAC2的過表達部分削弱了HDAC2對生長速度和腫瘤血管密度的作用(圖4c- f)。這些數(shù)據證實miR-500a-5p抑制了HDAC2介導的小鼠CRC細胞的生長。
 

4. miR-500a-5p受轉錄因子YY1負調控
為了確定miR-500a-5p受哪些因素調控，研究者分析了其基因上游1kb的基因組DNA序列。雙熒光素酶報告基因結果表明，該序列中含有miR-500a-5p啟動子。以往報道證實轉錄因子YY1與HDAC相互作用，因此作者研究了轉錄因子YY1能否調控CRC細胞中miR-500a-5p的表達。CONSITE軟件分析顯示YY1在miR-500a-5p啟動子上有3個潛在結合位點（?327~?333，?622~?628和?741~?747） (圖5a，b)。接著，將這三個位點序列分別構建熒光素酶載體，使之與YY1載體或空載體共轉染細胞進行雙熒光素酶檢測，結果表明，YY1的加入使這3個位點序列的啟動子活性均降低了2.5倍以上(圖5c)。為了證實YY1能夠在體內與miR-500a-5p啟動子結合，作者在過表達YY1的CRC細胞中用YY1抗體進行了ChIP-qPCR檢測，確定miR-500a-5p啟動子區(qū)域的這3個潛在結合位點均有顯著富集(圖5d)。

接下來，他們分析了YY1和miR-500a-5p在CRC組織中的表達關系，發(fā)現(xiàn)癌組織中有更高水平的YY1（蛋白和RNA）和更低水平的miR-500a-5p (圖5e，f)。此外，CRC細胞中YY1的瞬時表達導致miR-500a-5p成熟體、前體和初始轉錄本的轉錄都減少了(圖5g)。研究者還評估了HDAC2或YY1的表達與臨床病理參數(shù)之間的關系。結果表明，HDAC2和YY1的表達與CRC分化程度、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關。最后，采用免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)方法檢測基因表達。結果顯示，miR-500a-5p在CRC組織中的表達明顯低于癌旁組織，HDAC2和YY1的表達明顯高于癌旁組織。miR-500a-5p的表達與HDAC2或YY1呈負相關（圖5h）。這些結果表明，YY1下調了CRC細胞miR-500a-5p的水平，進而影響HDAC2水平。  
 

5. YY1/p300/HDAC2復合體調控了CRC細胞中miR-500a-5p的水平
由于組蛋白乙?；绞艿浇M蛋白乙酰轉移酶(CBP/p300, HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)的共同調控。以往報道指出，HDAC2和p300均可與YY1相互作用，因此研究者進一步探討了HDAC2-p300，HDAC2-p300-YY1的作用關系。過表達和內源性P300蛋白的Co-IP實驗均顯示P300可以與HDAC2和YY1相互作用(圖6a，c)，過表達和內源性HDAC2蛋白的Co-IP實驗也證實了這一結果(圖6b，d)，表明HDAC2-p300-YY1可能以復合物形式存在。

為了探討miR-500a-5p與YY1/p300/HDAC2復合體的關系，設置如下組別：YY1、HDAC2、p300、YY1+p300、HDAC2+p300、YY1+HDAC2+p300；轉染細胞后檢測miR-500a-5p水平，發(fā)現(xiàn)p300可促進miR-500a-5p轉錄，YY1或HDAC2抑制其轉錄，p300與HDAC2和/或YY1的組合也抑制其轉錄(圖6e)，表明YY1或HDAC2對p300有拮抗作用。之后以上7組載體分別與miR-500a-5p啟動子的熒光素酶載體共轉染細胞，檢測miR-500a-5p啟動的雙熒光素酶活性，進一步確定了p30的促進作用，及其YY1或HDAC2的抑制作用(圖6f)。ChIP實驗證實YY1和miR-500a-5p啟動子三個位點的結合程度受YY1自身水平，以及HDAC2和p300水平影響。YY1、HDAC2的過表達增加了YY1與miR-500a-5p啟動子3個位點的結合，而p300的過表達減少了YY1與這3個位點的結合(圖6g)；當干擾YY1、HDAC2和p300時，結果剛好相反(圖6h)。此外，p300的過表達則削弱了HDAC2與3個YY1結合位點的結合。這些結果表明，YY1/p300/HDAC2復合體調控了CRC細胞中miR-500a-5p的水平。
 

6. miR-500a-5p能夠抑制異種移植瘤和FK228治療的CRC腫瘤發(fā)展
為了研究miR-500a-5p在結直腸癌中的作用分子機制，研究者檢測了miR-500a-5p對細胞凋亡的影響，確定miR-500a-5P能誘導LoVo細胞凋亡。當miR-500a-5p與HDAC抑制劑FK228共同作用時，細胞凋亡率要顯著高于單獨轉染miR-500a-5p的組別(圖7a)。這些結果表明miR-500a-5p可促進腫瘤細胞凋亡，并增強腫瘤細胞對FK228誘導的凋亡的敏感性。為了探討miR-500a-5p對CRC的治療潛力，研究者建立了異種移植小鼠模型和FK228處理的CRC模型。結果顯示，移植LoVo細胞39天后，miR-500a-5p和miR-500a-5p+FK228組小鼠的腫瘤體積明顯小于m-NC組（圖7c，d）。TUNEL染色顯示，miR-500a -5P+FK228組的腫瘤細胞凋亡率最高(圖7e)。這些發(fā)現(xiàn)提示miR-500a-5p增強了癌細胞對HDAC抑制劑FK228誘導的凋亡的敏感性。以上結果表明，miR-500a-5p具有腫瘤抑制作用，具有治療CRC的潛力。

結論：
本研究確定miR-500a-5p在結直腸癌組織中下調，miR-500a-5p水平受到YY1/p300/HDAC2轉錄復合體的協(xié)同調控。此外，miR-500a-5p還通過直接結合HDAC2的3’UTR來抑制結直腸癌細胞增殖和遷移。